ערכת בדיקת מיני חמצן תגובתיים (ROS).

 

שם המוצר	חתול מס	מפרט
ערכת בדיקת מיני חמצן תגובתיים (ROS).	G1706-100T	100

 

 

ערכת בדיקת חמצן תגובתי (ROS), הידועה גם בשם ROS Assay Kit, היא ערכה לזיהוי ROS המבוססת על בדיקה הפלורסנטית DCFH-DA. DCFH-DA, הידוע גם בשם 2',7' -dichlorofluorescein diacetate, משקל מולקולרי 487.29, אין לו פלואורסצנטי בעצמו, יכול לחצות בחופשיות את קרום התא. לאחר כניסה לתאים, ניתן לבצע הידרוליזה של DCFH על ידי אסטראז, שקיים באופן נרחב בתאים. DCFH אינו חדיר לממברנת התא ולכן הוא לכוד בתוך התא. ניתן לחמצן DCFH לא פלואורסצנטי על ידי מיני חמצן תגובתי תוך תאי (ROS) ליצירת DCF ניאון, ועוצמת אות הקרינה הנוצר פרופורציונלית לרמת ה-ROS התוך תאי. ניתן להעריך בעקיפין את רמת מיני החמצן התגובתי התוך תאי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה קונפוקלית בלייזר.

ערכת Assay של מיני חמצן תגובתיים (ROS) יכולה לזהות ROS תוך תאי במהירות וביעילות עם רגישות גבוהה וקל לשימוש. במקביל, מסופק ריאגנט אינדוקציה חיובי ROS, שיכול לגרום לרמות ROS במספר סוגים של תאים בזמן קצר כדי לספק דגימות חיוביות. אם לוקחים את כמות הדגימה שנוספה לכל באר של 6-צלחת הבאר כחישוב הסטנדרטי, ניתן למדוד ערכה זו כ-100 פעמים.

 

 

הובלה עם קרח רטוב; אחסן ב--20 מעלות הרחק מאור, תקף ל-12 חודשים.

 

 

רְכִיבמִספָּר	רְכִיב	G1706-100T
G1706-1	בדיקה DCFH-DA	100 μL
G1706-2	מעורר חיובי חמצן תגובתי (2×)	20 מ"ל
מדריך הוראות		1 מחשב

 

 

1. הכנה לפני הניסוי:

1.1. הכנת תמיסת עבודה DCFH-DA: תמיסת עבודה DCFH-DA הוכנה על ידי דילול בדיקה של DCFH-DA עם מדיום תאים ללא סרום או תמיסת מלח מאוזנת של Earle's (G4213) ביחס של 1:1000.

1.2. (אופציונלי) הכנת תמיסת עבודה מעורר ROS חיובי: 1 × תמיסת עבודה מעורר חיובית של ROS הוכנה על ידי ערבוב ודילול של המשרה חיובי ROS (2×) עם מדיום תאים נטול סרום או תמיסת מלח מאוזנת של Earle's (G4213) בתמיסת 1:1 כֶּרֶך.

 

2. (אופציונלי) הכנת תאים לקבוצת ביקורת חיובית:

2.1. המדיום המקורי הוסר על ידי תאים נצמדים במצב טוב, והמדיום הוסר באמצעות צנטריפוגה;

2.2. תאים נדבקים או תאים מורחקים כוסו בתמיסת עבודה של גורם מעורר חיובי של מיני חמצן תגובתיים והודגרו ב-CO₂אינקובטור ב-37 מעלות למשך 45 דקות תחת אור (הרגישות של תאים שונים שונה. אם לא נצפתה עלייה במיני חמצן תגובתיים לאחר 45 דקות של גירוי, ניתן להאריך את זמן האינדוקציה בצורה מתאימה או להגדיל את ריכוז הגורם המעורר; אם העלייה של מיני חמצן תגובתיים מהירה מדי, ניתן להקטין את זמן האינדוקציה או את ריכוז הגורם המעורר כראוי).

 

3. זיהוי מיני חמצן תגובתי של תאים נצמדים:

3.1. לוח זרעי תאים: לפחות יום אחד מראש, התאים במצב טוב זורעים באופן שווה לתוך צלחת הבאר לפי צפיפות מסוימת, ותרופות או טיפול מקדים אחר מתבצע בהתאם לצרכים הניסויים (צפיפות החיסון נקבעת לפי גודל התא, קצב הגדילה וגורמים אחרים, כדי להבטיח שמפגש התא הוא 50-70% במהלך הבדיקה);

3.2. שטיפת תאים: הסר את המדיום של תרבית התא ושטוף אותו במאגר PBS (G4202) 1-2 פעמים כדי להפחית את ההפרעה של סרום, תרופות וחומרים אחרים על תוצאות הניסוי:

3.3. טעינת בדיקה: הסר את חיץ הכביסה בשאיבה, הוסף את הנפח המתאים של תמיסת העבודה DCFH-DA לפי הטבלה שלהלן, ודגירה ב-CO₂אינקובטור ב 37 מעלות למשך 30 דקות תחת אור. לאחר מכן נשאבה תמיסת העבודה של DCFH-DA ונשטפה במאגר PBS 2-3 פעמים כדי להסיר במלואה את הבדיקה העודפת; לבסוף, התאים כוסו ב-PBS.

 

צלחת תרבות תאים	פתרון עבודה/באר לזיהוי מיני חמצן תגובתי
6-טוב	1000 μL
12-טוב	500 μL
24-טוב	250 μL
48-טוב	200 μL
96-טוב	100 μL

 

3.4.זיהוי ROS: התאים המסומנים בצלחת הבאר הונחו ישירות לתוך מיקרוסקופ הקרינה או המיקרוסקופ הקונפוקאלי לצורך התבוננות. או לאחר העיכול, התאים נאספו וזוהו על ידי ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי, קורא מיקרופלטות, ציטומטר זרימה ומכשירים אחרים. עם אורך גל עירור של 488nm ואורך גל פליטה של ​​525nm, ספקטרום הקרינה של DCF דומה מאוד לזה של FITC, וניתן להגדיר את הפרמטרים של FITC כדי לזהות DCF.

2. זיהוי מיני חמצן תגובתיים בתאי ההשעיה (מתאים גם לתאים נצמדים שהופסקו מחדש לאחר עיכול וטיפול מקדים):

2.1. טיפול מקדים בתאים: בחרו תאים במצב טוב בהתאם לדרישות הניסוי, וצנטריפו אותם ב-1000 סל"ד למשך 3-5 דקות לאחר טיפול תרופתי או אחר בהתאם לדרישות הניסוי לאיסוף תאים (צפיפות התאים תיקבע בהתאם לשלב הבא). מערכת זיהוי, שיטה וכמות כוללת, למשל, מספר התאים בדגימה בודדת על ידי זיהוי זרימה לא יפחת מ-104);

2.2. שטיפת תאים: שטפו 1-2 פעמים עם חיץ PBS, צנטריפוגה ב-1000 סל"ד למשך 3-5 דקות כדי להסיר את הסופרנטנט ולאסוף תאים;

2.3. טעינת בדיקה: הוסף נפח מסוים של תמיסת עבודה DCFH-DA כדי ליצור צפיפות תאים של 1x105-5x105 תאים/מ"ל, ודגירה ב-CO₂אינקובטור ב-37 מעלות למשך 30 דקות בחושך. במהלך התקופה, נער בעדינות את התערובת כל 5 דקות כדי להבטיח מגע מלא בין הבדיקה לתא. בסיום הדגירה, תמיסת העבודה DCFH-Da הוסרה בצנטריפוגה ב-1000 סל"ד למשך 3-5 דקות ונשטפה 2-3 פעמים עם חיץ PBS כדי להסיר כראוי בדיקות עודפות. לבסוף, התאים הושעו מחדש ב-PBS.

2.4. זיהוי ROS: ניתן לזהות תאים המסומנים עם בדיקה ישירות על ידי ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי, קורא מיקרופלטות, ציטומטר זרימה וכו'. ניתן גם להפיל אותו על שקופית ולצפות במכשירים כגון פלואורסצנטי או מיקרוסקופיה קונפוקלית. עם אורך גל עירור של 488nm ואורך גל פליטה של ​​525nm, ספקטרום הקרינה של DCF דומה מאוד לזה של FITC, וניתן להגדיר את הפרמטרים של FITC כדי לזהות DCF.

 

 

1. אם עוצמת הקרינה הכוללת לאחר תיוג בדיקה גבוהה מדי או נמוכה מדי במהלך הניסוי, ניתן להתאים את יחס הדילול וזמן הדגירה של בדיקה DCFH-DA כראוי.

2. אם הבדיקה לא נכנסת לתא, היא תגרום לרקע גבוה. נא לנקות אותו עד כמה שניתן.

3. הגורם החיובי של מיני חמצן תגובתי משמש בעיקר להשראת דגימות ביקורת חיוביות. לפי הצרכים הניסויים, האם להיות שליטה חיובית או לא.

4. כל צנטריפוגה של תאים תגרום לאובדן מסוים לצפיפות התאים הכוללת. אנא שימו לב לשלוט בכמות התא ההתחלתית כדי למנוע מכמות התא הסופית להיות לא מספיקה לזיהוי.

5. עקב כיבוי בדיקה פלורסנטית, אנא נסה לקצר את הזמן מדגירת הבדיקה ועד לגילוי (למעט זמן הגירוי).

6. למען בריאותך ובטיחותך, נא ללבוש מעיל מעבדה וכפפות בעת ההפעלה.

 

לשימוש מחקר בלבד!

 

 

תגיות פופולריות: ערכת בדיקת מיני חמצן תגובתיים (ros), יצרנים, ספקים, מפעלים של ערכות לבדיקת מיני חמצן תגובתיים (ros)