2×Universal Blue SYBR Green QPCR Master Mix

 

שם המוצר	חָתוּל. לֹא.	מפרט
2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix	G3326-00	200 μL
	G3326-01	1 מ"ל
	G3326-05	5×1 מ"ל
	G3326-15	15×1 מ"ל

 

 

2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix הוא מיקס קדם 2× מיוחד לתגובות qPCR בשיטת הקרינה הכימרית SYBR Green I. מרכיב הליבה Taq DNA Polymerase הוא פולימראז DNA התחלה חם המבוסס על שיטת הכליאה של נוגדנים, שיכול לעכב ביעילות הגברה לא ספציפית בתנאי טמפרטורה נמוכה, ובמקביל עם מאגר התגובה המותאם ל-qPCR, הוא מתאים מאוד לתגובת qPCR עם סגוליות ורגישות גבוהה, והוא יכול להשיג עקומת תקן טובה בתוך אזור כמותי רחב, ולכמת את גן המטרה עם מדויק, ניתן לשחזור ואמין ביותר. יחד עם זאת המוצר מכיל צבע ROX Passive Reference מיוחד המתאים לשימוש בכל מכשירי ה-qPCR, ואין צורך להתאים את ריכוז ה-ROX במכשירים שונים. תמיסה מעורבת מראש מתווספת עם צבע כחול, עם תוספת של חומר מעקב, תוך תמיכה במתן מדלל תבנית צהובה, כאשר התבנית מדוללת בדילול תבנית צהובה ומוסיפה לתמיסת התגובה הכחולה המעורבבת מראש, הצבע משתנה מכחול לירוק, ניתן לגבש את מערכת התגובה כך שתמלא תפקיד במעקב אחר תהליך מערכת התגובה, כדי למנוע דליפה של התוספת או הוספה שגויה. הספקטרים ​​של צבע כחול וצהוב זה אינם חופפים לצבע qPCR ואינם משפיעים על תוצאות התגובה.

 

 

ספינה עם קרח רטוב; חנות ב--20 תואר, תקף ל-12 חודשים.

 

 

מספר רכיב	רְכִיב	G3326-00	G3326-01	G3326-05	G3326-15
G3326-1	2x אוניברסלי כחול SYBR ירוק qPCR מאסטר מיקס	200 μL	1 מ"ל	5 x 1 מ"ל	15 x 1 מ"ל
G3326-2	40x מאגר דילול תבנית צהוב	200 μL	1 מ"ל	1 מ"ל	1 מ"ל
יָדָנִי		עותק אחד

 

 

1. (אופציונלי) דילול תבנית

מאגר הדגימה הצהוב מסופק בריכוז של 40X עבור דילול תבנית DNA, שיכול לקבוע במדויק אם התבנית נוספה לתמיסת התגובה qPCR על ידי שינוי צבע הנוזל. אם לוקחים את מערכת התגובה 20-μL qPCR כדוגמה, בהתאם לכמות תבנית הדילול שנוספה לתמיסת התגובה qPCR 20μL, ניתן להפנות את שיטת הדילול המתאימה של התבנית המקורית לטבלה הבאה (לקיחת התבנית המקורית מדוללת ל-100μL כדוגמה):

הוסף את התבנית המדוללת לתמיסת התגובה qPCR 20μL (μL)	1	2	3	4	5	6	7	8
הוסף את מאגר דילול התבנית 40x צהוב למערכת דילול התבנית 100μL (μL)	50	25	16.7	12.5	10	8.4	7.2	6.3
הוסף את מערכת דילול תבנית 100μL לתבנית הראשית (μL)	x	x	x	x	x	x	x	x
נפח הוספת Nuclease - מים חופשיים (μL)	50-x	75-x	83.3-x	87.5-x	90-x	91.6-x	92.8-x	93.7-x

 

לדוגמה: יש להוסיף תבנית מדוללת של 2μL למערכת התגובה qPCR 20-μL. ניקח כדוגמה את מערכת דילול תבנית 100μL. אם נפח התבנית המקורי הוא 20μL, מתווסף 25μL 40x Yellow Template Dilution Buffer, ולאחר מכן מוסיפים מים ללא Nuclease 55μL לנפח הכולל של 100μL. מאגר דילול התבנית 40x צהוב הוא כעת פי 10. הוסף 2μL מהתבנית המדוללת לתוך 20-μL מערכת תגובה qPCR, והריכוז הסופי של 40× YELLOW Template Dilution Buffer הוא פי 1. או אם אינך רוצה להשתמש בדילול התבנית עבור G3326-2, תוכל להתעלם משלב זה.

1. 2. מערכת תגובה qPCR מומלצת:

רְכִיב	20 μL rxn	50 μL rxn	ריכוז סופי
2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix	10 μL	25 μL	1×
פריימר קדימה (10μM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
פריימר הפוך (10μM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
תבניתב	מִשְׁתַנֶה	מִשְׁתַנֶה	כנדרש
מים ללא נוקלאז	הוסף ל-20 μL	הוסף ל-50 μL

ת: בדרך כלל, ניתן להשיג אפקט הגברה טוב עם הריכוז הסופי של {{0}}.2 מיקרומטר. כאשר ביצועי התגובה גרועים, ניתן להתאים את ריכוז הפריימר בטווח של 0.2-1.0 מיקרומטר.

ב: כמות התבנית שנוספה משתנה בהתאם למספר העותקים של גן המטרה, והכמות המתאימה של הוספת תבנית נלמדת על ידי דילול שיפוע. כמות התוספת הטובה ביותר של תבנית DNA במערכת התגובה של 20 μL הייתה פחות מ-100 ננוגרם. כאשר נעשה שימוש ב-cDNA (תמיסת תגובה RT) של תגובת RT-PCR כתבנית, כמות התוספת לא תעלה על 10% מנפח ה-qPCR הסופי.

2. 3. תוכנית תגובת PCR (ניתן להתאים בהתאם למכשירים):

א שיטת שני שלבים					ב. שיטת שלושת השלבים
שָׁלָב	שָׁלָב	מספר מחזור	טֶמפֶּרָטוּרָה	זְמַן	שָׁלָב	שָׁלָב	מספר מחזור	טֶמפֶּרָטוּרָה	זְמַן
שלב 1	ניוון קדם	1	95 מעלות	30 שניות	שלב 1	ניוון קדם	1	95 מעלות	30 שניות
שלב 2	נִווּן	40	95 מעלות	15 שניות	שלב 2	נִווּן	40	95 מעלות	15 שניות
	חישול-הרחבה		60 מעלות	30 שניות		רִכּוּך		תואר 55-65	10 שניות
						הַרחָבָה		72 מעלות	30 שניות
שלב 3	עקומת התכה	1	הגדרות ברירת המחדל של המכשיר		שלב 3	עקומת התכה	1	הגדרות ברירת המחדל של המכשיר

ת: אם יש צורך לשפר את סגוליות ההגברה, ניתן להשתמש בהליך דו-שלבי או בטמפרטורת חישול; כדי לשפר את יעילות ההגברה, ניתן להשתמש בהליך בן שלושה שלבים או זמן הארכה.

 

 

1. אם אין צורך במעקב אחר פיפטה, דילול התבנית אינו מבוצע באמצעות מאגר דילול התבנית 40×Yellow Template.

2. לפני השימוש בריאגנטים, אנא הפוך בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב, אל תערבב ותנודד כדי למנוע בועות.

3. בעת הכנת תמיסת התגובה, שמור את הריאגנטים על קרח.

4. מוצר זה מכיל את הצבע הפלורסנטי SYBR Green, ויש להימנע מאור חזק בעת הכנת תמיסת תגובת PCR.

5. אנא השתמש בעצות חד פעמיות חדשות להכנה וניפוק של תמיסת תגובה כדי למנוע זיהום צולב בין דגימות ככל האפשר.

6. הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת של מאסטר מיקס ונסה להשתמש בו תוך חודש לאחר ההפשרה.

מכשירים תואמים

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, סדרת QuantStudio™, PikoRealTM Cycler;

Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™;

Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;

Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;

IIIumina: Eco QPCR;

Cepheid: SmartCycler®;

Qiagen Corbett: סדרת Rotor-Gene®;

Roche: סדרת LightCycler™;

Takara: סדרת Thermal Cycler Dice;

אנליטיקה: סדרת qTOWER;

qTOWER: סדרת LineGene.

 

 

1. מומלץ שאורך תוצר ההגברה יהיה בין 80-300 bp;

2. אורך פריימר: 18-25 bp;

3. תכולת הבסיס G+C בפריימרים צריכה להיות בין 40%-60%;

4. הפרש ערך Tm בין פריימרים קדימה לפריימרים לאחור הוא פחות מ-2 מעלות, וערך Tm בין מעלות 58-62 הוא הטוב ביותר;

5. אקראיות של התפלגות הבסיס;

6. עדיף פריימרים לא להכיל רצפים משלימים עצמיים, אחרת הם יהוו מבנה סיכת ראש משני;

7. לא צריך להיות יותר מ-4 בסיסים משלימים או הומולוגיים בין שני פריימרים, אחרת יווצר פריימר דימר, במיוחד חפיפה משלימה בקצה ה-3';

8. הבסיס המסוף 3' של הפריימר מוצע להיות G או C;

9. לא נמצאו מוצרים לא ספציפיים אחרים בתוצאות ההשוואה של NCBI.

 

 

תיאור הבעיה	סיבות אפשריות	פתרונות
בסוף התגובה לא הופיעה עקומת הגברה או ערך CT הופיע מאוחר מדי	ריכוז התבנית נמוך מדי	חזור על הניסוי כדי להפחית את מספר הדילול של התבנית, והתחל מהריכוז הגבוה ביותר כאשר ריכוז הדגימה אינו ידוע
	השפלה של התבנית	התבנית הוכנה שוב והניסוי חזר על עצמו
	ישנם מעכבי PCR במערכת	בדרך כלל, התבנית נלקחת פנימה, יחס הדילול של התבנית גדל או שהתבנית עם טוהר גבוה מוכנה וחוזרת על עצמה
	פריימרים עלולים להתקלקל	יש לבדוק תחילה את תקינותם של פריימרים שלא היו בשימוש זמן רב באמצעות אלקטרופורזה של PAGE כדי לשלול אפשרות של פירוק
	יעילות הגברה נמוכה	הגדל את ריכוז הפריימר, נסה הליך הגברה בן שלושה שלבים, או תכנן מחדש את הפריימר
	מוצר ההגברה ארוך מדי	אורך מוצר ההגברה נשלט בטווח של 80-300 bp
הפקד הריק מציג את האות	זיהום מערכת התגובה	ראשית, יש להחליף את מי הבקרה הריקים. אם אותו מצב עדיין מתרחש, יש להחליף את הפריימרים, האספירטורים וצינורות ה-PCR או להתחיל ב-Master Mix חדש. מערכת התגובה מוכנה בטבלה סופר נקייה להפחתת זיהום אירוסול
	מופיעה הגברה לא ספציפית כגון דימרי פריימר	בדרך כלל, זה נורמלי שמוצרי ההגברה יופיעו בבקרה ריקה לאחר 35 מחזורים, אשר יש לנתח עם עקומת ההיתוך. עיצוב מחדש של פריימר, התאם את ריכוז הפריימר או ייעול הליך תגובת PCR
לעקומת ההיתוך יש מספר פסגות	עיצוב פריימר גרוע	הפריימר החדש עוצב מחדש לפי עקרונות עיצוב הפריימר
	ריכוז הפריימר גבוה מדי	הפחת את ריכוז הפריימר כראוי
	יש זיהום גנומי בתבנית cDNA	תמיסת ה-RNA המופקת מתעכלת באמצעות אנזימי DNA, כגון dsDNase, להסרת זיהום גנומי, או לתכנון פריימרים של טרנסינטרון
יכולת שחזור לקויה של ניסויים	השגיאה בהוספת מדגם גדולה	השימוש בפיפטה מדויקת, עם פיפטה מדויקת של ראש יניקה באיכות גבוהה; תבנית דילול גבוהה, הוספת תבנית נפח גדול כדי להפחית שגיאות דגימה; נפח התגובה של qPCR הוגדל
	ריכוז התבנית נמוך מדי	חזור על הניסוי כדי להפחית את זמני הדילול של התבנית
	סטיית טמפרטורה במיקומים שונים של מכשיר ה-qPCR	כייל את מכשיר ה-qPCR באופן קבוע
עקומת ההגברה אינה חלקה	אות הקרינה חלש מדי, מופק לאחר תיקון המערכת	ודא שהצבעים המעורבבים מראש ב-Master Mix אינם מתכלים; החלף אות ניאון כדי לאסוף חומרים מתכלים טובים יותר של qPCR
עקומת הגברה נשברת או מחליקה	ריכוז התבנית היה גבוה יותר וערך נקודת הקצה הבסיסי היה גדול מערך ה-CT	נקודת הסיום הבסיסית (ערך Ct -3) הופחתה והנתונים נותחו מחדש
עקומות הגברה של וולס בודדים ירדו לפתע בחדות	יש בועות בצינור התגובה	ודא ש-MIX מומס לחלוטין, ואל תסתחרר ותתנדנד באופן שווה; לאחר הוספת המדגם, הבועות מוסרות על ידי צנטריפוגה עם אלסטי קל. זמן הטרום דנטורציה הוארך ל-10 דקות כדי להסיר את הבועות

 

לשימוש מחקר בלבד!

 

 

תגיות פופולריות: 2×סיבר כחול אוניברסלי ירוק qpcr מיקס מאסטר, סין 2×סיבר כחול אוניברסלי ירוק qpcr מאסטר מיקס יצרנים, ספקים, מפעל