IF488-כתם Phalloidin

 

שם המוצר	חָתוּל. לֹא	מפרט
IF488-כתם Phalloidin	G1248-100T	100 T

 

 

Phalloidin, שבודד במקור כפפטיד דו-ציקלי מהפטרייה הרעילה Amanita phalloides, נקשר לחוט האקטין F-actin עם זיקה וסגוליות גבוהות מאוד, ואינו קושר אקטין מונומרי (G-actin). לפאלואידין יש זיקה דומה לסיבים קטנים וגדולים, ובעצם נקשרים לפי היחס הסטוכיומטרי של תת-יחידת אקטין אחת למולקולת פאלואידין אחת בתאי שריר ולא שרירים של מיני צמחים ובעלי חיים רבים ושונים. שלא כמו נוגדני אקטין, הזיקה לחלבונים ממונעים משתנה באופן ניכר ממין או מקור אחד למשנהו. קישור לא ספציפי של פאלואידין הוא כמעט זניח, וההבדלים בין אזורים מוכתמים ובלתי מוכתמים בולטים מאוד. Phalloidin ונגזרותיהם יכולים לצבוע F-actin בריכוזים ננומולריים, מה שמאפשר תיוג קל מאוד, זיהוי ומחקר כמותי של הפצת F-actin.

מוצר זה הוא צבע פלואורסצנטי IF488-מסומן פאלואידין, בהתאם לשימוש של 100 μL של תמיסת עבודה לכל צביעה של תא באר, ניתן להשתמש במוצר זה לצביעה של 100 תאים.

 

 

הובלה עם קרח רטוב. אחסן ב--20 מעלות הרחק מאור, תקף ל-12 חודשים.

 

 

רְכִיב	G1248-100T
IF488-כתם Phalloidin	100 T
מדריך הוראות	1 מחשב

 

 

1. הכינו בעצמכםחיץ 1×PBS(pH 7.2-7.4, מומלץG4202), BSA(מוּמלָץGC305010), מְיַצֵב(מכיל 4% פרפורמלדהיד, מומלץG1101), פתרון לשבירת סרטים(0.1%-0.5% Triton X-100 מומס ב-PBS, מומלץG1204), סילר מרווה נגד פלואורסצנטי(מוּמלָץG1401), פתרון צביעת DAPI מוכן לשימוש(מוּמלָץG1012), וכו'.

2. בעת שימוש במוצר זה בפעם הראשונה, המיס במלואו וצנטריפוגה במהירות נמוכה למשך דקה אחת כדי למנוע אובדן של דופן הצינור הנוזל. מומלץ לחלק את המוצר בהתאם לכמות המשמשת בניסוי בודד כדי למנוע אובדן של ממס על ידי הנידוף. אחסן ב--20 מעלות הרחק מאור.

3. לפני ניסויים רשמיים, הוכן PBS המכיל 1% BSA, כלומר, 1.0 גרם BSA הומס לכל 100 מ"ל של PBS. לאחר מכן נשאבו 1 μL של IF488-Phalloidin Stain וערבבו עם 200 μL-500 ul PBS המכילים 1% BSA כדי לקבל 1× מתמיסת העבודה של Phalloidin Staining. אפקט הצביעה עשוי להיות שונה עבור סוגים שונים של תאים, אנא עיין בספרות לריכוז העבודה האופטימלי של צביעה או בצע את הבדיקה המוקדמת כדי לברר זאת. השתמש בתמיסת הצביעת Phalloidin באותו יום בה היא מוכנה ומאוחסנת בטמפרטורת החדר ומוגנת מאור.

 

 

1. תאים מתורבתים נזרקו (בצפיפות של לפחות חצי מפגש), מצע התרבות הוסר, והתאים נשטפו עם חיץ 1× PBS שחומם מראש ב-37 מעלות כדי לשטוף את התאים 2 פעמים;

2. מקבע המכיל 3.0-4.0% פורמלדהיד התווסף כדי לכסות את התאים ותוקן למשך 15-30 דקות בטמפרטורת החדר;

הערה: מתנול הורס אקטין, ולכן אסור שהמקבע יכיל מתנול והימנע משימוש בתמיסות פורמלדהיד המכילות מתנול;

3. תאים נשטפו עם חיץ PBS 1× 2-3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר;

4. התאים כוסו ב-PBS המכיל 0.1% Triton X-100 בטמפרטורת החדר ועברו חלחול למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר;

5. תאים נשטפו עם חיץ PBS 1× 2-3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר;

6. לאחר שזחילות התאים נוערו יבשות קלות, ציירו עיגול בעזרת עט פאפ כך שהתאים ממוקמים במרכז העיגול. קח 100 μL מהתמיסה המוכנה IF488-Phalloidin Staining כדי לכסות את התאים לחלוטין, ודגירה בטמפרטורת החדר והרחק מאור למשך 30-120 דקות. שים לב שבדרך כלל, תואר 4-37 מתאים לצביעה. כדי למנוע אידוי של תמיסת העבודה המכתים המוביל לפרוסות יבשות, תהליך הדגירה מחייב הנחת זחילות התאים במיכל אטום, כגון קופסה רטובה חסינת אור. בנוסף, תוספת של 1% BSA לתמיסת הכתמת Phalloidin יכולה להפחית ביעילות את הרקע;

7. תאים נשטפו עם חיץ PBS 1× 2-3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם;

8. (אופציונלי)הוסף טיפות של תמיסת צביעת DAPI מוכנה לשימוש לשקופיות הסורק כדי לכסות את התאים, ובצע צביעה גרעינית למשך 3-5 דקות. לשטוף את התאים עם חיץ PBS 1× 2-3 פעמים למשך 30-60 שניות כל אחד;

9. זחילות תאים נוערו מעט יבשות והופכות על שקף עם טיפה של סילר מרווה אנטי פלואורסצנטי, וה-for-sealer נמחק עם מגבת נייר;

[שלב אופציונלי]:לאחר השלמת שלב 7, ניתן גם להפוך את כיסוי הכיסוי ישירות לשקופית שעברה טיטרציה עם סילר מרווה אנטי פלואורסצנטי המכיל DAPI (מומלץ G1407), ואז ניתן לשאוב את הסילר העודף. התבונן בתוצאות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או מיקרוסקופיה קונפוקלית בלייזר.

10. התוצאות נצפו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או מיקרוסקופיה קונפוקלית בלייזר כאשר ערוצי IF488 (Ex/Em=493/517 nm) ו-DAPI (Ex/Em=364/454 nm) נבחרו.

 

 

1. יחידה אחת (T) של Phalloidin מסומן פלואורסצנטי מוגדרת ככמות הצבע המשמשת לצביעה של שקופית של תאים טעונים.

2. מתנול יכול להרוס חלבון אקטין, ולכן אין להשתמש בתמיסת קיבוע המכילה מתנול בקיבוע מוקדם של דגימות. זמן הקיבוע מומלץ לשלוט בין 15-30 דקות בצורה אופטימלית.

3. Phalloidin לרוב אינו חדיר ולעתים רחוקות משתמשים בו לצביעה של תאים חיים.

4. כל הצבעים הפלורסנטים מרובים, לכן מומלץ להשלים את הגילוי באותו יום ככל האפשר לאחר הצביעה.

5. Phalloidin הם רעילים ויש לטפל בהם בזהירות. ללבוש מעיל מעבדה וכפפות חד פעמיות במהלך הפעולה.

 

לשימוש מחקר בלבד!
Ver. לֹא.: V1.0-202308

 

 

תגיות פופולריות: if488-phalloidin stain, סין if488-כתמי phalloidin יצרנים, ספקים, מפעל